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Tuan Dung Ngo

Caractérisation et inhibition du Système de Sécrétion de Type III de Pseudomonas aeruginosa

Publié le 6 février 2019


Thèse soutenue le 06 février 2019 pour obtenir le grade de docteur de la Communauté Université Grenoble Alpes - Spécialité : Virologie, Microbiologie, Immunologie

Résumé :
Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste gram-négatif qui cause des maladies nosocomiales et infecte les patients atteints de la mucoviscidose. Le Système de Sécrétion de Type III (SST3) est un de ses facteurs de virulence les plus importants et permet d’injecter directement quatre exotoxines dans les cellules hôtes. Une protéine très importante du SST3 est l’ATPase PscN qui est impliquée dans l’assemblage et le fonctionnement de ce système. Dans ce travail, nous mettons en évidence l’interaction de PscN avec des protéines sécrétées du SST3, avec leurs chaperonnes seul ou en complexes, en utilisant trois technique de ELISA, HTRF et MST. En particulier, la MST (Microscale Thermophoresis) nous a permis de déterminer les constantes de dissociation (Kd) entre ces protéines et PscN. Les résultats montrent que l’ATPase interagit préférentiellement avec les protéines sécrétées ou les complexes plutôt que les chaperonnes, ce qui confirme le fait que celles-ci sont libérées dans le cytoplasme bactérien après la dissociation des complexes. Par ailleurs, en évaluant le Kd entre des complexes d’effecteur, de translocateur ou d’aiguille et l’ATPase liée ou non au complexe « Gate-keeper », qui est connu comme un régulateur de sécrétion de protéines sécrétées par SST3, nous montrons que l’affinité de PscN avec le complexe de l’aiguille est considérablement augmentée en présence de ce régulateur. Ainsi, un nouveau rôle est assigné au complexe « Gate-keeper » dans la régulation de la sécrétion hiérarchique du SST3, en contrôlant le chargement du complexe de l’aiguille sur l’ATPase.
En parallèle, nous avons pris l'opportunité de caractériser les effets ex vivo et in vivo de molécules identifiées dans un criblage antérieur in vitro en raison de leur capacité à inhibe l’interaction entre PscE et PscG. Ces deux protéines sont les deux chaperonnes cytoplasmiques de PscF, la protéine de l’aiguille du SST3. Cette interaction est une cible intéressante pour une stratégie anti-virulence car des simples ou doubles mutations ponctuelles dans l’interface d’interaction de PscE-PscG diminuent la virulence de P. aeruginosa. Ce travail met en avant les deux meilleures molécules « leads » dont la structure est très proches et qui appartiennent à un cluster hybride combinant les hits de deux libraries de molécules. Ces deux composés inhibent les dommages cellulaires causés par des souches de P. aeruginosa possédant le SST3, ne sont pas toxiques pour des cellules eucaryotes et ont un effet minimal sur la croissance, la mobilité et le métabolisme de la bactérie. De plus, ces « leads » peuvent améliorer considérablement la survie de Galleria mellonnela lors d’infection par P. aeruginosa.

Jury :
Président : Mr Bertrand Toussaint
Rapportrice : Mme Ariel Blocker
Rapporteur : Mr Jean-Michel Jault
Examinateur : Mr Thiery Vernet
Examinatrice : Mme Sophie Bleves
Directeur de thèse : Mr Eric Faudry

Mots clés :
Pseudomonas aeruginosa, Système de Sécrétion de Type III, ATPase, Anti-virulence